多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的生物活性分子，在生命活动中扮演着关键角色。随着生物医药领域的迅速发展，人工合成多肽已成为药物研发、生物材料开发的重要手段。 一、多肽合成的基本概念
多肽是α-氨基酸以肽键连接而形成的化合物，作为蛋白质水解的中间产物，在生物体内具有重要的生理功能。根据氨基酸数量，由两个氨基酸组成的称为二肽，三个称为三肽，以此类推，通常由三个及以上氨基酸组成的化合物均可称为多肽。多肽与蛋白质的主要区别在于分子大小，含50个以上氨基酸残基的多肽通常被认为是蛋白质。
多肽合成是指在实验室或工业条件下，按照预设的氨基酸序列，通过化学方法将氨基酸逐个连接形成特定多肽链的过程。自1963年Bruce Merrifield提出固相多肽合成法（SPPS）并因此获得1984年诺贝尔化学奖以来，多肽合成技术经历了革命性发展，已成为多肽研究的基础技术。
二、多肽合成的核心方法
1. 固相合成法
固相合成法是目前多肽合成的主流技术，其基本原理是将目标多肽的C端氨基酸羧基以共价键形式与不溶性高分子树脂相连，然后以该氨基酸的氨基作为起点，与其他氨基酸已活化的羧基作用形成肽键，重复这一过程直至合成完整多肽链。
固相合成法主要分为两种策略：
BOC策略：采用叔丁氧羰基作为α-氨基保护基，合成过程中需反复使用CF3COOH脱BOC，最后用HF从树脂上切割。此法因HF需要专门仪器且易产生副反应，应用逐渐减少。
Fmoc策略：采用9-芴甲基氧羰基作为α-氨基保护基，可用哌啶-CH₂CL₂或哌啶-DMF脱去。Fmoc基对酸稳定，反应条件温和，在一般实验条件下即可进行，因此得到了广泛应用。
2. 液相合成法
液相合成法在溶液环境中进行缩合反应构建肽链，适用于较短肽链的合成。虽然此法灵活性较高，但每步反应后需要纯化步骤，操作较为复杂，对于长肽合成效率较低。
三、固相多肽合成的详细流程
1. 树脂预处理与氨基酸固定
合成开始时，首先将树脂加入固相合成仪中，用适当溶剂（如二氯甲烷，DCM）对树脂进行溶胀处理，使树脂颗粒空隙扩大，便于反应物扩散。溶胀后抽干溶剂，用DMF等溶剂洗涤树脂以去除杂质。
树脂作为固相载体需满足特定要求：必须包含反应位点以使肽链连接；对合成过程中的物理和化学条件稳定；允许不断增长的肽链和试剂之间快速接触；同时尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。常用树脂包括聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂等。
2. 氨基酸保护策略
成功合成特定氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护。氨基酸保护基的选择至关重要，不仅要防止副反应，还要能在特定条件下顺利脱除。
侧链保护也需要特别关注：天冬氨酸和谷氨酸侧链羧基常用t-Bu保护；半胱氨酸的-SH具有强亲核性，易被酰化成硫醚或被氧化，常用对甲苄基、对甲氧苄基等保护基；赖氨酸的ε-NH?必须采用与α-NH?不同的保护方式。
3. 缩合反应循环
缩合反应是多肽合成的核心步骤，从C端开始，将第一个氨基酸用DMF溶解，加入缩合剂（如DCC、HBTU等）进行活化后，加入固相合成仪中与树脂结合。随后进行以下循环步骤：
1. 脱保护：使用碱性溶液（如PIP/DMF溶液）脱除氨基酸N端的保护基团（如Fmoc）；
2. 洗涤：用DMF洗涤树脂，去除残留试剂；
3. 检测：使用Kaiser试剂等检测反应程度，确保脱保护；
4. 下一个氨基酸缩合：将下一个已活化的氨基酸加入系统，进行新一轮缩合反应。
这一循环重复进行，直至所有氨基酸按序列连接完毕。合成结束后，用适当溶剂（如异丙醇和DCM）对树脂进行交叉洗涤，完成树脂收缩操作。
四、多肽裂解技术与策略
1. 裂解前准备
裂解是将合成好的多肽从树脂上分离的过程。首先需要配置裂解液，通常包含TFA（CF3COOH）等强酸，并提前冷藏保存。裂解液的具体组成取决于多肽序列和侧链保护基性质。
对于Fmoc策略，裂解和脱侧链保护基通常采用弱酸，TFA是广泛应用的选择，可以脱除t-Bu、Boc等保护基。对于某些对弱酸稳定的保护基，可能需要使用更强的酸如HF或TMSBr等。
2. 裂解过程
将肽树脂加入反应釜中，加入预冷的裂解液，搅拌反应以使多肽从树脂上裂解下来。裂解时间取决于多肽长度和序列特征，通常需要数小时。
裂解完成后，将反应液放出，通过抽滤除去树脂，并用TFA等溶剂洗涤以确保较大程度回收多肽。此时获得的是多肽在裂解液中的溶液，需要进一步处理。
五、多肽的纯化与后处理
1. 粗肽提取
将裂解液转入旋转蒸发仪中，在室温下浓缩至小体积。随后加入适当的沉淀剂（如甲基叔丁基醚）使多肽析出，通过离心、洗涤等步骤得到粗肽。这一步骤可去除大部分可溶性杂质和裂解副产物。
2. 精细纯化
粗肽通常含有缺失序列、截短片段等杂质，需要进一步纯化。高效液相色谱（HPLC）是当前常用的多肽纯化方法，可高效分离目标多肽与杂质。
根据多肽特性，还可选择亲和层析、毛细管电泳等纯化方法。对于疏水性较强的多肽，可能需要采用特殊的溶剂系统和梯度洗脱策略。
3. 冻干与储存
纯化后的多肽溶液通过旋蒸除去有机溶剂，得到浓缩的多肽溶液。对其进行无菌过滤后，置于冻干机中，按设定程序进行冻干处理。冻干后的多肽产品应适当包装并存放在低温干燥环境中，以保持其稳定性。
多肽的不稳定性是其制剂研究中的主要问题之一，可能由脱酰胺反应、氧化、水解等多种因素引起。为提高多肽稳定性，可采取定点突变、化学修饰（如PEG修饰）或添加稳定剂等策略。
六、多肽合成技术的新进展
1. 自动化合成设备
全自动多肽合成仪的发展极大提高了合成效率与可重复性。现代合成仪具备高精度温度控制系统（精度可达±0.2℃）和智能监控系统，可实时反馈反应进程。多通道设计（如96通道）支持同时合成多个多肽序列，满足高通量筛选需求。
2. 裂解技术革新
新型裂解仪支持物理裂解（离子束、激光束）、化学裂解（酸性/碱性试剂）和酶解裂解等多种方法，可根据多肽特性选择最适裂解方式。自动化裂解流程减少了人工干预，提高了裂解效率与一致性。
3. 质谱分析应用
质谱技术在多肽分析中发挥重要作用。不同的碎裂方法如CID/HCD、ETD等可产生互补的碎片离子信息，实现全面的多肽序列表征。这为合成多肽的质量控制提供了强大工具。
七、多肽合成的应用前景
多肽合成技术已在多个领域展现广泛应用价值：
1. 药物研发：多肽药物在治疗癌症、糖尿病等多种疾病中展现出巨大潜力，如肽类激素、抗体片段、药物载体等。
2. 生物材料：通过改变多肽的氨基酸序列，可设计合成多肽仿生材料，如人工骨骼、人工血管等。
3. 诊断试剂：多肽作为抗原用于检测病原生物抗体，已应用于甲、乙、丙、庚型肝病病毒、艾滋病病毒等检测试剂。
4. 疫苗开发：多肽疫苗是疫苗研究领域的重要方向，如宫颈癌人乳头瘤病毒多肽疫苗已进入II期临床试验。
多肽合成技术经过数十年发展，已形成较为完善的理论体系和技术平台。随着自动化设备、分析方法和保护策略的不断进步，多肽合成的效率、纯度和应用范围将持续扩大。未来，随着对多肽折叠机制和结构-功能关系的深入理解，多肽合成技术将在生物医药领域发挥更加重要的作用。
